谷胱系列γ-谷氨酰連接酶(GCL)測試盒_微量法

測定方法：微量法

產品規格：100管/96樣

注    意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 對 GCL 有反饋抑制作用。GCL基因表達受多種因素調節，如氧化劑、抗氧化劑、生長因子和炎癥因子等。GCL活性高低對GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影響。

測定原理：

在ATP和Mg2+存在下，GCL催化Glu和Cys合成γ-谷氨酰Cys；同時ATP去磷酸化產生無機磷分子，通過測定無機磷增加速率，即可計算出GCL活性。

自備儀器和用品：

冷凍離心機、水浴鍋、移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、濃硫酸和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體105mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加6 mL蒸餾水充分震蕩溶解。

試劑三：粉劑×1管，4℃保存。臨用前加入蒸餾水1.5 mL充分震蕩溶解。

試劑四：液體7mL×1瓶，室溫保存。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入12 mL蒸餾水，充分震蕩溶解后，緩緩加入400µL濃硫酸（自備），邊加邊攪拌。

谷胱系列γ-谷氨酰連接酶(GCL)測試盒_微量法

粗酶液提?。?/p>

1.組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2.細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后8000g，4℃，離心10min，取上清置于冰上待測。

3.血清等液體：直接測定。

GCL測定操作：

1.分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到660nm，蒸餾水調零。

2.空白管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和蒸餾水24µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min；再加入試劑四60µL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A空白管。

3.測定管：取1.5mLEp管，依次加入試劑一48µL、試劑二52µL、試劑三12µL和上清液24µL，混勻后蓋緊，37℃水浴準確反應15 min；再加入試劑四60µL，混勻后，室溫（25℃左右）8000g，離心10 min，

4.取上清100µL，加入試劑五100µL，混勻后蓋緊，45℃水浴10min，冷卻后測定660nm處光吸收，記為A測定管。

注意：空白管只需要測定一次。